Образование

Гибридизация ДНК: понятие, определение, этапы развития и применение

Что лежит в основе гибридизации ДНК? Хотя двухцепочечная ДНК -последовательность в целом стабильная в физиологических условиях, изменение этих условий в лаборатории (как правило, путем повышения температуры окружающей среды) приведет к тому, что молекулы будут разделены на отдельные нити. Последние являются взаимодополняющими друг к другу, но могут также дополнять другие последовательности, присутствующие в их окружении. Опускание окружающей температуры позволяет однонитевым молекулам отжигать или «гибридизоваться» друг с другом. Это и есть метод гибридизации ДНК.
Гибридизация ДНК: понятие, определение, этапы развития и применение - новости образования и науки на News4Smart.ru

Понятие с точки зрения молекулярной биологии

Ученые, занимающиеся как репликацией ДНК, так и транскрипцией ДНК в РНК, полагаются на скрещивание нуклеотидов между собой и методы молекулярной биологии. Сюда включаются Саузерн-блоты и Нозерн-блоты, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и большинство подходов к секвенированию и гибридизации ДНК-РНК.

Гибридизация ДНК: понятие, определение, этапы развития и применение - новости образования и науки на News4Smart.ru

Применение

Гибридизация является основным свойством нуклеотидных последовательностей и используется в многочисленных методах молекулярной биологии. Общая генетическая взаимосвязь двух видов может быть определена путем гибридизации сегментов их ДНК (ДНК-ДНК-гибридизация). Из-за сходства последовательностей между близкородственными организмами требуется более высокая температура для таяния таких гибридов ДНК по сравнению с более удаленными организмами. Различные методы используют гибридизацию для определения происхождения образца ДНК, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР). В другом методе короткие последовательности ДНК гибридизуются с клеточной мРНК для идентификации экспрессируемых генов. Фармацевтические компании изучают использование антисмысловой РНК для связывания с нежелательной мРНК, предотвращая рибосому от перевода мРНК в белок.

Гибридизация ДНК: понятие, определение, этапы развития и применение - новости образования и науки на News4Smart.ru

ДНК-ДНК-гибридизация обычно относится к методу молекулярной биологии, который измеряет степень генетического сходства между пулами последовательностей ДНК. Он обычно используется для определения генетического расстояния между двумя организмами. Это широко использовалось в филогении и таксономии.

Методология

ДНК одного организма метили, затем смешивали с не меченной ДНК, которую можно было сравнить с ней. Смесь инкубируют, чтобы позволить цепям ДНК диссоциировать и затем охлаждаться с образованием возобновленной гибридной двухцепочечной ДНК. Гибридизированные последовательности с высокой степенью сходства будут более жестко связываться и требуют больше энергии для их разделения: т. е. они разделяются при нагревании при более высокой температуре, чем разнородные последовательности, процесс, известный как «плавление ДНК».

Плавление ДНК

Оценивая профиль плавления гибридизованной ДНК, двухцепочечную ДНК связывают с так называемой «колонкой», а получившуюся смесь нагревают. На каждом этапе колонку промывают, а последовательности ДНК, которые плавятся, становятся одноцепочечными и смывают колонну. Температуры, при которых помеченная ДНК выходит из колонки, отражает количество сходства между последовательностями (и образец самосгибания служит в качестве контроля). Эти результаты объединены, чтобы определить степень генетического сходства между организмами. Как утверждает современная микробиология, гибридизация ДНК невозможно без понимания этих вещей.

Гибридизация ДНК: понятие, определение, этапы развития и применение - новости образования и науки на News4Smart.ru

Когда несколько видов рибонуклеиновой (или дизоксирибонуклеиновой) кислоты сравниваются таким образом, значения сходства позволяют размещать виды в филогенетическом дереве. Следовательно, это один из возможных подходов к проведению молекулярной систематики. Чарльз Сибли и Джон Альквист, пионеры этой техники, использовали ДНК-ДНК-гибридизацию для изучения филогенетических отношений птиц (систематика Сибли-Алквиста) и приматов.

Значение для биологии

ДНК-ДНК-гибридизация является золотым стандартом для различения бактериальных видов с величиной сходства более 70%, что указывает на то, что сравниваемые штаммы относятся к разным видам. В 2014 году был предложен порог 79% сходства для разделения бактериального подвида.

Гибридизация ДНК: понятие, определение, этапы развития и применение - новости образования и науки на News4Smart.ru

Критики утверждают, что техника неточна для сравнения близких видов, так как любая попытка измерить различия между ортологическими последовательностями между организмами перегружена гибридизацией паралоговых аналогов в геноме организма. Секвенирование ДНК и вычислительные сравнения последовательностей в настоящее время обычно являются методом определения генетического расстояния, хотя этот подход все еще используется в микробиологии, чтобы помочь идентифицировать бактерии.

Современный способ заключается в проведении гибридизации ДНК-ДНК в силиконе с использованием полностью или частично секвенированных геномов. GGDC, разработанный в DSMZ, является наиболее точным известным инструментом для вычисления DDH-аналогичных значений. Среди других алгоритмических улучшений он решает проблему с паралогическими последовательностями, тщательно фильтруя их из совпадений между двумя последовательностями генома.

Гибридизация ДНК: понятие, определение, этапы развития и применение - новости образования и науки на News4Smart.ru

Метод FISH

Флуоресцентная гибридизация молекул ДНК (Fluorescence In Situ Hybridization — FISH) представляет собой лабораторный метод, используемый для обнаружения и определения последовательности ДНК, часто на определенной хромосоме.

Гибридизация ДНК: понятие, определение, этапы развития и применение - новости образования и науки на News4Smart.ru

В 1969 году Джозеф Галл и Мэри Лу Парду опубликовали документ, демонстрирующий, что радиоактивные копии последовательности рибосомной ДНК могут быть использованы для обнаружения комплементарных последовательностей ДНК в ядре лягушечьего яйца. Начиная с этих оригинальных наблюдений, многие уточнения повысили универсальность и чувствительность процедуры до такой степени, что гибридизация in situ («на своем месте», латынь) в настоящее время считается важным инструментом в цитогенетике. (Термином in situ в настоящее время также обозначают начальную стадию роста карциномы, когда в патологический процесс вовлечена лишь эпителиальная ткань.)

Гибридизация ДНК: понятие, определение, этапы развития и применение - новости образования и науки на News4Smart.ru

Последовательность флуоресцентной гибридизации

РНК-зонды могут быть сконструированы для любого гена или любой последовательности внутри гена для визуализации мРНК lncRNA и miRNA в тканях и клетках. FISH используется путем изучения цикла клеточного размножения, в частности интерфазы ядер для любых хромосомных аномалий. FISH позволяет анализировать большую серию архивных случаев, намного легче идентифицировать выявленную хромосому, создавая зонд с искусственным хромосомным основанием, который будет привлекать подобные хромосомы.

Сигналы гибридизации для каждого зонда, когда обнаруживается аномалия ядра: каждый зонд для обнаружения мРНК и lncRNA состоит из 20 пар олигонуклеотидов, каждая пара покрывает пространство 40-50 б. п. Для обнаружения мРНК зонды используют запатентованную химию.

Гибридизация ДНК: понятие, определение, этапы развития и применение - новости образования и науки на News4Smart.ru

Гибридизация с ДНК-зондами

Зонды часто получают из фрагментов ДНК, которые были выделены, очищены и амплифицированы для использования в проектировании генома человека. Размер человеческого генома настолько велик по сравнению с длиной, которая может быть секвенирована напрямую, что необходимо разделить его на фрагменты. В конечном счете эти фрагменты приводились в порядок путем переваривания копии каждого фрагмента в еще более мелкие элементы с использованием эндонуклеаза, специфичных для последовательностей, для измерения размера каждого небольшого фрагмента с использованием эксклюзионной хроматографии с использованием этой информации для определения, где большие части перекрывались друг с другом.

Чтобы сохранить элементы с их индивидуальными последовательностями ДНК, фрагменты были добавлены в систему постоянно повторяющихся популяций бактерий. Клональные популяции бактерий, каждая популяция, поддерживающая единую искусственную хромосому, хранятся в различных лабораториях по всему миру. Искусственные хромосомы (BAC) можно выращивать, извлекать и помечать в любой лаборатории, содержащей библиотеку. Геномные библиотеки часто называются в честь учреждений, в которых они были разработаны. Примером может служить библиотека RPCI-11, названная в честь Института рака Розуэлла в Буффало (Нью-Йорк, США). Эти фрагменты составляют порядка 100 тысяч базовых пар и являются основой большинства зондов FISH.

Гибридизация ДНК: понятие, определение, этапы развития и применение — все интересные факты и достижения науки и образования на News4Smart.ru

Поделитесь ссылкой и ваши друзья узнают, что вы знаете ответы на все вопросы. Спасибо ツ

Related Articles

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Close